Il Museo del Tesoro della Basilica di San Francesco è sorto e si è sviluppato a partire dal XIII secolo. Il nucleo è costituito da opere di uso liturgico, custodite nelle sagrestia segreta della Chiesa inferiore.

Nel corso dei secoli, la collezione si è arricchita di preziose donazioni, reliquie, libri liturgici e paramenti. I pezzi più importanti sono: Il calice della bottega orafa senese di Guccio Mannaia del 1290, donato da Papa Niccolò IV, primo pontefice dell'Ordine dei Frati Minori. La tavola con San Francesco e quattro miracoli di guarigione, opera della scuola del pittore Giunta Pisano, della metà del XIII secolo, e l'arazzo monumentale con santi e papi dell'Ordine di bottega fiamminga, donazione del papa francescano Sisto IV del 1478.
Dal 1977 il museo è ospitato nella sala gotica del Sacro Convento e dagli anni Ottanta la collezione si è arricchita di 57 opere di pittura italiana del XIII-XVII secolo, provenienti dal eredità del collezionista e critico d'arte Frederick Mason Perkins.

L'attuale Direttore è fra Thomas Freidel.